双孢菇菌丝的适宜生长温度为22～26℃，因此，培养室内应尽量保持此温度，坚决避免出现30℃以上的温度，以免细菌污染。同时培养室还要遮光，保持室内黑暗。在培养期间，要利用夜间通风，保持室内空气新鲜；每隔3～4天，喷洒一次杀菌剂与杀虫剂；每7～10天检查1次，挑出被杂菌污染的菌种，保持菌种的纯度。正常情况下，25～30天菌丝即可长满全瓶，继续培养3～5天，就可用于生产。
接种后第3天即开始检查剔杂，发现任何非双孢菇菌丝的菌瓶，随即移出室外。有链孢菌污染的，应用方便袋从上往下套住菌瓶，慢慢移出。对一般杂菌的污染，可喷施药物后将料倒出，晒干后再次利用；对链孢菌污染，应远离培养室倒料，并予焚烧或深埋。空瓶用70℃以上热水烫杀，洗净后再用。
经35～45天菌种完成发菌，暂时不用的菌种应低温存放，一般保持2～4℃条件即可。
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