培养料是双孢菇生长发育的物质基础，双孢菇菌丝体直接生长在培养料内，出菇以后，子实体生长发育所需要的营养均来自培养料。
双孢菇栽培基料中，主料占总重量的90%～95%，是双孢菇生长发育的主要营养来源。辅料虽占培养基的5%～10%，但它能补足培养料中的营养成分，调节碳氮比例和酸碱度；改善培养基的理化性状，促进堆料中微生物的活动和繁殖，提高堆料的发酵质量。
(1) 培养料主料
双孢菇培养料主料是鸡粪、牛粪和稻草、麦草。
鸡粪、牛粪：含有丰富的碳素和矿物质，是双孢菇生长所需氮素的主要来源。
稻草、麦秸：含有丰富的碳素，是双孢菇生长时碳素的最主要来源。麦草要求新鲜、无霉变、质地坚挺，具有弹性。被雨淋发热变质或霉烂的草料，不可能得到高产优质的双孢菇。新鲜草料的含碳量为47%～48%。
(2) 培养料辅料
双孢菇的生长需要较多钙、磷、钾、硫等矿质元素，因此，培养料中常加有一定量的石膏、石灰、过磷酸钙、草木灰、硫酸铵等。
①过磷酸钙：含有效磷酸15%～20%，堆料中添加过磷酸钙可补充磷、钙素的不足，促进微生物的分解活动，有利于堆料的发酵腐熟，还能与堆料中过量的游离铵结合形成氨化过磷酸钙，防止培养料铵态氮的逸散。过磷酸钙是一种缓冲物质，具有改善培养料理化性状作用，磷本身又是子实体生长发育不可缺少的物质。一般过磷酸钙用量为1%～2%，通常在第二次翻堆时一次性加入。
②熟石灰：石灰除用于调节酸碱度、补充钙元素外，还有降解培养料中农药残留量的作用。此外，石灰还常用作消毒剂、杀菌和防潮剂，被誉为双孢菇的“万金油”。
③石膏：可直接补充双孢菇生长的硫、钙营养元素，虽然不含氮磷钾，但能使气态氮固定成化合态氮，能减少培养料中的氮素损失，还能加速培养料有机质分解。培养料中添加石膏，可使草料脱脂软化，防止发料中的腐殖质凝结成颗料结构，使粘结的料变得松散，有利于氨气挥发，改善培养料的透气状况，促进微生物的繁殖活动，提高培养料的持水力和保肥力。石膏能中和双孢菇菌丝产生的草酸，一般用量2%～5%，第一次翻堆时一次加入。
④尿素：主要用于补充培养料中的氮素。
