双孢菇在整个生长发育时期所需的水分，主要来自于培养料、覆土层和空气，不同的生长发育时期，双孢菇对水分的要求是不同的。
双孢菇菌丝体生长阶段，培养料中的含水量应保持在60%左右，低于50%菌丝体生长不良，表现出菌丝生长缓慢，绒毛状菌丝多而细，难以形成子实体。
若培养料的含水量高于70%，会使料内透气性差。菌丝生活力降低，培养料中部难以长透菌丝。料表面菌丝表现出稀疏无力，甚至萎缩。子实体形成和长大要求较高的湿度，一般以培养料表层的含水量为60%～60%，覆土层的含水量为18%～20%，空气相对湿度90%左右为最适宜。
在菌丝体生长阶段，覆土层要偏干，含水量维持在18%左右（能用手捏扁）；子实体生长阶段，覆土层要稍偏湿，含水量应在20%左右（土粒能搓圆，稍粘手）。覆土层过干，双孢菇瘦小，产量低；覆土层过湿，特别是在出菇期一次喷水过多，水分渗透至培养料内，会使菌丝萎缩。
菌丝生长期间，空气相对湿度宜保持在70%左右，湿度过高易感染杂菌。反之，若空气相对湿度低于50%，培养料内水分蒸发过度，则不利于菌丝生长。出菇期间对空气相对湿度的要求与菌型有关，气生型菌株要求偏干，以空气相对湿度80%～85%为宜；贴生型菌株，出菇期空气相对湿度要达到85%～95%。
空气相对湿度过低，会使覆土层很快干燥，子实体生长缓慢，菌盖上易产生鳞片，甚至出现龟裂，菇柄空心。空气相对湿度低于50%时，会停止出菇，已分化的小菇蕾亦萎缩死亡。空气相对湿度过大时，菌盖上长期留有雾滴，易发生各种杂菌和病害，极易发生细菌性斑点病。
在子实体发生时期，要时常开窗能通风换气，二氧化碳浓度不高于0.05%～0.1%，当超过一定浓度时会阻碍菌丝体生长和子实体的发育，常发生双孢菇子实体柄细长、畸形菇增多、开伞早等现象。
